تقنية PCR

تقنية الPCR

________________________________________
تهدف تقنية PCR إلى تضخيم جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA، بعد استخلاصه من خلايا أو سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه يمكن إجراء التحليل عليه. يمكن اعتبار تقنية PCR ترجمة مبسطة لعملية انتساخ الحمض النووي DNA أثناء الانقسام الخلوي.ولكي يتم هذا الانتساخ، لا بد من توفر مواد معينة تساعد على ذلك:

1-البادئات Primers وهي عبارة عن نيوكلوتيدات قليلة( Oligonucleotides (18 – 20 أساس آزوتي قادرة على الارتباط مع الأسس الآزوتية للحمض النووي المراد تضخيمه، وذلك في منطقة ذات ترتيب مميز ونوعي غير متبدل للأسس الازوتية في الحمض النووي أو ما يعرف بمنطقة عالية الحفظ Highly Conserved Region .

2- كميات وافرة من النيوكليوزيدات ثلاثية الفوسفات منقوصة الأوكسجين
(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Deoxynuleoside triphosphates(dNTPs)

3-أنظيم البوليميراز Polymerase مقاوم للحرارة المرتفعة، وأهمها Taq Polymerase المستخلص من بكتيريا تعيش في الينابيع الحارةThermus aquaticus.

4-محاليل واقيه Buffers

5-شوا رد مناسبة، أهمها شاردة المغنيزيوم Mg+2 التي تعتبر عامل متمم Cofactor لأنظيم البوليمراز.

تتألف تقنية PCR من ثلاث مراحل في دورة واحدة:
• مرحلة التمسخ الحراري Thermal denaturation لجزيءDNA الهدف، أي فصل الطاق المزدوج
ds-DNA إلى طاقين منفصلين ss-DNA. وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 94 م .

• مرحلة تشفع البادئات Primers annealing، أي ارتباط كلا البادئتين مع الطاقين المنفصلين عند درجة حرارة 55م

• تطاول البادئات المتشفعة Annealed primers extension بمساعدة أنظم البوليمراز وذلك بإضافة dNTPs ابتداء من البادئة وفي الاتجاه 3← 5، وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 72 م.

يمكن تطبيق تقنية PCR على الحمض النوويRNA بإجراء خطوه أولية وهي تكوين نسخة متممة من
ComplementaryDNA(cDNA)DNA
بواسطه انظيم الترنسكريتباز العكوسreverse transcriptase، ليخضعcDNA بعدها لمراحل التتضخيم السابقة.
وتعرف هذه التقنيةRT-PCR


تستخدم تقنية ال PCR في مجالات عديدة منها الكشف المباشر للعامل الخمجي الممرض (جرثومي – فيروسي – طفيلي... ) قبل ارتكاس الجهاز المناعي لهذا العامل (إنتاج الأضداد). في الماضي، يتم الكشف عن العامل الممرض بشكل غير مباشر عن طريق كشف/ معايرة الأضداد:
- إيجابية كاذبة ← أضداد غير نوعية
- سلبية كاذبة ← تأخر ظهور / إنتاج الأضداد لأسباب مناعية.
وبشكل مباشر عن طريق الزرع ← صعوبة زرع الفيروسات
طول فترة الزرع كمال هي الحال في عصيات السل


-تحديد الأنماط الجينية Genotyping للفيروس الكبدي C

- الأمراض الوراثية– الكشف عنها قبل ظهور الأعراض والعلامات
– الكشف عنها عند الجنين أثناء الحمل، أو في حديثي الولادة

- تشخيص الأمراض السرطانية بالكشف الجيني للتوضع الغير طبيعي للأسس الآزوتية للجينات الورميه Oncogenes

-تعيين الأنماط النسيجية HLA- tissuc typing في مجال زراعة الأعضاء

- تلعب تقنية PCR دوراً هاماً في الطب الجنائي والشرعي.



Figure 1: The different steps in PCR. pdf file of this picture




Figure 2 : The exponential amplification of the gene in PCR


Figure3 : Verification of the PCR product on gel.

thank you too much